細(xì)胞培養(yǎng)污染拯救及預(yù)防方法

§ 污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。

§ 一開始就要十分重視，防止污染，否則會(huì)前功盡棄，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。

（一）污染的類型

§ 細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。

1、細(xì)菌污染

§ 細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ姷挠懈锾m氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

§ 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

2、真菌污染

§ 真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

§ 培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。

§ 真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

3、支原體污染

§ 支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。

§ 培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。

                   陽性                                                  陰性

4、病毒污染

§ 組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。

§ 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

5、非同種細(xì)胞污染

§ 由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。

§ 非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

（二）、污染的鑒別

1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)

§ （1）肉眼觀察  

§ 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

§ （3）接種觀察  

§ 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。

§ （2）鏡下觀察  

§ 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。

§ 若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

2、支原體污染的檢測(cè)

§ （1）相差顯微鏡觀察

§ 直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。

§ 應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。

§ （2）熒光染色法觀察  

§ 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。

A positive

§ （3）電鏡檢測(cè)  

§ 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。

§ （4）培養(yǎng)檢測(cè)  

§ 將細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。

3 、病毒的檢測(cè)

§ 1) 應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病

§ 2) 逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測(cè)病毒

（三）、污染的清除

§ 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。

§ 若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

一、細(xì)菌和真菌的清除

§ 1、使用抗生素

§ 抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。

§ 預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。

（二）、支原體的清除

§ １、用MRA處理

§ 用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康．

§ 效果好．

§ 2、用清洗純化法清除支原體污染的方法

§ 細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌

§ 其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限.

§ 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。

§ 3、藥物輔助加溫處理

§ 先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。

４、使用支原體特異性血清

§ 用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。

§ 但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。

（四）、污染的預(yù)防

§ 預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。

§ 一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

1、添加抗生素

2、從物品、用品消毒滅菌著手

§ 細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。

§ 操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3、從操作者做起

§ （1）進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

§ （2）操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

§ （3）操作時(shí)要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。

4、防止細(xì)胞交叉污染

§ 在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。

§ 在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

§ 細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。

５、無菌室的徹底消毒

§ 1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室；

§ 2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對(duì)各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。