陰性對照出現陽性結果

試劑/樣品污染

試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器。

夾心ELISA - 檢測抗體與包被抗體反應

確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體,他們之間不會互相反應。

酶標板洗板不徹底

用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈。

抗體量過多導致非特異結合

根據推薦用量使用抗體。盡量使用較少的抗體。

酶標板整體背景高

結合反應太強或時間過長

檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當酶標板顯色足夠進行吸光度讀取時立即用終止液終止反應。

底物溶液或終止液不是新配制

使用新配制的底物溶液。終止液應該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標志，需要重新配制）。

沒有終止反應

如果底物反應沒有被終止，顏色會繼續變化。

酶標板在酶標儀讀板前放置時間過長

顏色會繼續變化（盡管加了終止液，依然會以很慢的速度變化)。

試驗器皿污染

確保試劑是新配的并且使用的是清潔的玻璃器

底物孵育過程沒有避光

底物孵育應該在避光條件下進行。

孵育溫度過高

抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性。確保孵育在正確的溫度下進行，孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優化。

抗體非特異性結合

確保進行了封閉并使用的是恰當的封閉液。我們建議使用 5-10% 的與二抗同種動物來源的血清或牛血清。

確保板孔經過預處理以防止非特異結合。使用親和力強、純度高的抗體，最好經過了預吸收。

請檢查針對“陰性對照出現陽性結果”的建議

吸光度數值低

使用的樣品中沒有顯示出靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低

檢查靶蛋白表達系統，確保它在您的樣品中被表達出來。如果靶蛋白的表達水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇

一個更靈敏 的測定方法。確保您使用的是沒有超出測定方法檢測范圍的陽性對照。

抗體不足

確定使用的是建議的抗體量，為了使結果更好可能需要增加抗體的濃度。

底物溶液不是新鮮配制或成分有誤

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

試劑不是新鮮配制或pH值有誤

確保試劑配制正確并在有效期內。

孵育時間不夠長

如果建議了孵育時間，確保按推薦的時間長度孵育抗體。為了使結果更理想，孵育時間可能需要增加。

孵育溫度太低

抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性，確保孵育是在正確的溫度下進行，孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優化。確保所有的試劑在使用前是室溫。

未加終止液

加入終止液可以增加顯色反應的強度，也能固定反應最終的顏色。

吸光度數值高

樣品和/或陽性對照吸光度數值高。吸光度沒有按樣品在板子上的稀釋度遞減。

樣品或陽性對照的濃度過高，超出了試驗方法檢測的范圍。重新設置試驗方法或者在加樣前通過稀釋降低樣品和對照的濃度，在處理結果計 算濃度時考慮到所作的稀釋。

酶標板上吸光度不規律

孵育時酶標板疊在一起酶標板疊在一起使板子每個孔的溫度不能平衡一致，請避免堆疊。

吸液不一致

確保移液器使用正確并經過校準、確保槍頭插得足夠緊密。板子稀釋時要特別仔細，注意確保每個槍頭都吸上和排出正確量的液體，這對平 行樣品結果的一致性有很大影響。

抗體稀釋液/試劑未混勻

為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被混合均勻。

板孔變干涸

確保所有孵育期間酶標板始終被蓋好。放置一個潮濕的水盤(保持清潔，無菌水)在孵育箱的底部。

洗板不充分

這將導致一些孔沒有其他孔清洗的好，殘留不同量的未結合的抗體，使后面的結果產生不一致。

酶標板底部不凈影響吸光度讀取

讀板前小心清潔酶標板底部。

顏色變化過慢

酶標板未處于恰當的溫度中確保酶標板處于室溫，試劑在使用前也處于室溫。

結合能力太弱

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

溶液污染

例如象疊氮化鈉和過氧化物酶這類污染物的存在，將會影響底物的反應，避免使用含有這些防腐劑的試劑。