嘌呤霉素

Puromycin dihydrochloride（10mg/ml）

產(chǎn)品簡介：

嘌呤霉素（Puromycin），來源于白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）代謝產(chǎn)物的一種氨基糖苷類抗生素，有效抑制革蘭氏陽性菌生長，對抗酸桿菌的抑制活性相對較弱，但對革蘭氏陰性菌的抑制活性更弱。還能抑制原生生物、藻類、哺乳動物和昆蟲細(xì)胞的生長，一般2天內(nèi)能殺死99%的細(xì)胞。作用機(jī)制在于：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的結(jié)構(gòu)類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸肽鏈中，導(dǎo)致肽鏈合成的永久終止，進(jìn)而阻止蛋白質(zhì)合成。嘌呤霉素還具有抗腫瘤活性。作為蛋白合成抑制劑，用來研究細(xì)胞分化中控制基因順序表達(dá)和協(xié)同表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

對嘌呤霉素的抗性來自嘌呤霉素產(chǎn)生菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因，其表達(dá)產(chǎn)物嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（puromycin N-acetyl-transferase）可通過乙酰化嘌呤霉素使其失活。這一特性使得嘌呤霉素常用來篩選和維持培養(yǎng)攜帶pac基因的哺乳動物細(xì)胞株，特別是慢病毒感染的細(xì)胞株。現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。某些情況下，也能用來篩選攜帶pac基因的大腸桿菌菌株。嘌呤霉素在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用。

本品為溶于水的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，濃度為10mg/ml，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾得到的無菌溶液，直接用培養(yǎng)基稀釋到工作濃度即可。真核細(xì)胞常用的篩選濃度為1-10μg/ml。

產(chǎn)品特性

1） 化學(xué)名：3'-[α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3'-deoxy-N,N-dimethyladenosine dihydrochloride

2） 同義名：Stylomycin hydrochloride; CL 13900 dihydrochloride; P638 dihydrochloride; CL16536; NSC 3055;

3） CAS NO：58-58-2

4） 分子式：C22H29N7O5·2HCl

5） 分子量：544.43 g/mol

6） 外觀：無菌溶液

7） 純度：＞98% (HPLC)

保存條件: 

-20℃干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

1、 試劑準(zhǔn)備

第一次收到本品，可根據(jù)單次用量，將嘌呤霉素（10mg/ml）無菌分裝，置于-20℃保存，盡量減少反復(fù)凍融次數(shù)。

2、建議工作濃度

哺乳動物細(xì)胞：1-10 μg/ml，最佳工作濃度使用宿主細(xì)胞殺滅實(shí)驗(yàn)（殺滅曲線）來確定；

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選敏感轉(zhuǎn)化菌株，使用濃度為100-125μg/ml。

【注意】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子不僅需精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身狀態(tài)影響。

3、殺滅曲線的建立

嘌呤霉素合適的篩選濃度與細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、代謝情況，以及細(xì)胞所處周期等因素有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞所需的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次實(shí)驗(yàn)一定要建立殺滅曲線（kill curve），篩選到適合自身實(shí)驗(yàn)體系的最優(yōu)篩選濃度。

1）于24孔板加入500μl/孔制備好的細(xì)胞懸液，鋪?zhàn)銐虻目滓员ＷC后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。37℃細(xì)胞孵育過夜。理想情況開始抗生素篩選時(shí)，細(xì)胞達(dá)到較高的密度（~60-80%），常用的細(xì)胞密度如下：

貼壁細(xì)胞：0.8 - 3.0 x 105 cells/ml

懸浮細(xì)胞：2.5 - 5.0 x 105 cells/ml

2）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含梯度濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（比如，設(shè)置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，這11個(gè)篩選濃度，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔）；

3）將孵育過夜的細(xì)胞清洗后，更換新鮮制備的梯度篩選培養(yǎng)基；之后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；

4）根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基；

5）每日監(jiān)測細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非感染細(xì)胞的抗生素最低濃度，也就是將用到的最優(yōu)篩選濃度。

【注意】：如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變圓但沒有從平板表面脫落可能是以下情況，

a）變圓但是未脫落是細(xì)胞開始死亡的一個(gè)信號，這些需要更長的篩選時(shí)間；

b）若在建議濃度1-10μg/ml范圍內(nèi)還不能完全處死細(xì)胞，此時(shí)需要檢測藥物是否有效，避免藥物的反復(fù)凍融（<5）。

注意事項(xiàng)：

1）嘌呤霉素為有毒化合物，操作時(shí)需注意防護(hù)，切勿與身體或皮膚直接接觸。

2）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。