SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a

產品簡介

SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實時定量PCR預混液，使用時只需加入模板和引物即可進行反應。采用創(chuàng)新的熱啟動機制可以減少引物二聚體和其他次級產物對反應的干擾，可以顯著提高定量PCR的特異性、擴增效率，得到更廣的可定量擴增區(qū)域。采用了新的增強劑，對各種目的片段 PCR 效率的波動可控制在最小范圍內，反復凍融對擴增性能影響極小。本品配有進口參比染料ROX，適用于需要ROX校正的定量PCR機型，如ABI等。

產品組成

a 包含SYBR? Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反應緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應體系的2%，請根據(jù)需要調整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長期保存。

質量控制

純度檢測：經(jīng)質量檢測，產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：經(jīng)不同來源的模板和引物檢測，產品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

[1] DNA模板建議用量（10-20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度，效率低時可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現(xiàn)雜峰，可以減少Mix用量至8 μl（20 μl體系）；如果對痕量模板的檢出率較低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl體系）。

[4] 對于某些固定型號的儀器，需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX的雜峰背景干擾，在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項，然后再進行數(shù)據(jù)的收集與分析。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。

[5] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

2. 設定反應程序進行qPCR反應

注：本品含有熱啟動酶，在60℃時會抑制酶活性，因此不建議使用兩步法，推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。

經(jīng)典三步法程序示例如下：

本品可用極速三步法快速完成反應，程序示例如下：

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。

[2] 150 bp以內的擴增子可設置為5 sec；150-300 bp的擴增子可設置為10 sec；300 bp以上的擴增子可適當延長時間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同，一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可。可在延伸（三步法）或退火延伸（兩步法）階段采集信號，也可在反應結束后72 hrs之內采集（避光低溫保存）。

3. 分析結果

觀察擴增曲線；調整基線，計算Ct值；觀察熔解曲線檢測特異性；進行相對或絕對定量。

注意事項

? 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將（n+x）份反應液混勻后再分注到n個單管中，可降低加樣誤差。（n為重復次數(shù)，x為損耗量，一般為n的1/10）

? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應液，避免產生氣泡，氣泡會干擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物，隨實驗結果適當調整引物用量（0.05-0.9 μM）——特異性較差時減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴增效率較低時增加引物用量。

? DNA模板的量應小于500 ng/反應，過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據(jù)模板類型與基因表達量適當調整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的，初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產物的特異性。產物特異性不好的原因有：引物特異性低；退火溫度設置偏低；引物/模板濃度偏高；等。同時，建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性。