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SYBR Green qPCR Mix(with Rox)

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GDSBio(東盛)  SYBR Green qPCR Mix
  • GDSBio(東盛)  SYBR Green qPCR Mix

SYBR Green qPCR Mix(with Rox)

貨號:P2091a(1ml), P2092a(1mlx5) ,P2093a(1mlx10)
品牌:東盛
價格: 400.00~3420.00
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P2091a P2092a P2093a

SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #:P2091a,P2092a,P2093a

產品簡介


SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實時定量PCR預混液,使用時只需加入模板和引物即可進行反應。采用創(chuàng)新的熱啟動機制可以減少引物二聚體和其他次級產物對反應的干擾,可以顯著提高定量PCR的特異性、擴增效率,得到更廣的可定量擴增區(qū)域。采用了新的增強劑,對各種目的片段 PCR 效率的波動可控制在最小范圍內,反復凍融對擴增性能影響極小。本品配有進口參比染料ROX,適用于需要ROX校正的定量PCR機型,如ABI等。

產品組成


Component

P2091a

P2092a

P2093a

2X SYBR? Green qPCR Mixa

1 ml

1 ml × 5

1 ml × 10

100X ROX Reference Dye*

40 μl

200 μl

400 μl

超純水

1 ml

1 ml × 5

-

a 包含SYBR? Green I,Hotstart Taq DNA聚合酶,Aptamer,dNTP及反應緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應體系的2%,請根據(jù)需要調整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年,4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長期保存。

質量控制


純度檢測:經(jīng)質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:經(jīng)不同來源的模板和引物檢測,產品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

Component

Volume

Final   concentration

DNA template[1]

0.5-2 μl

1-4 μl

Variable

Forward primer (10 μM)[2]

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

Reverse primer (10 μM)

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

2X SYBR? Green qPCR Mix[3]

5 μl

10 μl

1X

100X ROX Reference Dye[4]

Variable

Variable

Variable

ddH2O

Variable

Variable

-

Total volume[5]

10 μl

20 μl

-

[1] DNA模板建議用量(10-20 μl體系):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小,以免造成較大的誤差,但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度(加樣前):cDNA 1-10 ng/μl,gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍:0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現(xiàn)雜峰,可以減少Mix用量至8 μl(20 μl體系);如果對痕量模板的檢出率較低,可以增加Mix用量至12 μl(20 μl體系)。

[4] 對于某些固定型號的儀器,需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此,為了避免ROX的雜峰背景干擾,在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項,然后再進行數(shù)據(jù)的收集與分析。由于ROX的使用體積較小,建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明,下表僅供參考。

Instruments

ROX (100X)

ABI PRISM 7000/   PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

1-2% (High ROX)

ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000

0.2% (Low ROX)

Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

No ROX

[5] 建議總體積不小于10 μl,以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

2. 設定反應程序進行qPCR反應

注:本品含有熱啟動酶,在60℃時會抑制酶活性,因此不建議使用兩步法,推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。

經(jīng)典三步法程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

15 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

15 sec

Extension

72℃

20 sec

Dissociation/Melting curve analysis(optional)[3]

本品可用極速三步法快速完成反應,程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

5 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

5 sec

Extension

72℃

5-10 sec[2]

Dissociation/Melting curve analysis(optional)[3]

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃,若低于55℃,則以Tm值為退火溫度,一般不低于55℃。

[2] 150 bp以內的擴增子可設置為5 sec;150-300 bp的擴增子可設置為10 sec;300 bp以上的擴增子可適當延長時間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同,一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可。可在延伸(三步法)或退火延伸(兩步法)階段采集信號,也可在反應結束后72 hrs之內采集(避光低溫保存)。

3. 分析結果

觀察擴增曲線;調整基線,計算Ct值;觀察熔解曲線檢測特異性;進行相對或絕對定量。

注意事項

? 使用前Mix需要完全解凍,充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將(n+x)份反應液混勻后再分注到n個單管中,可降低加樣誤差。(n為重復次數(shù),x為損耗量,一般為n的1/10)

? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異,Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應液,避免產生氣泡,氣泡會干擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物,隨實驗結果適當調整引物用量(0.05-0.9 μM)——特異性較差時減少引物用量,或以3℃為增量提高退火溫度,擴增效率較低時增加引物用量。

? DNA模板的量應小于500 ng/反應,過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據(jù)模板類型與基因表達量適當調整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的,初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產物的特異性。產物特異性不好的原因有:引物特異性低;退火溫度設置偏低;引物/模板濃度偏高;等。同時,建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性。


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