雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
 

產品簡介：

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit）是一種高效的檢測工具。它首先利用螢光素（luciferin）作為底物，檢測螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）的活性；隨后，以腸腔素（coelenterazine）作為底物，檢測海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性。在加入海腎螢光素酶底物的過程中，試劑盒會同時添加一種抑制劑，用于抑制螢火蟲螢光素酶對luciferin的催化發光反應，從而確保后續檢測僅針對海腎螢光素酶的活性，實現精準的雙螢光素酶報告基因檢測。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61 kD的蛋白質，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化luciferin氧化生成oxyluciferin，并在此過程中發出生物螢光（bioluminescence）。海腎螢光素酶則是一種分子量約為36 kD的蛋白質，在氧氣存在的條件下，可以催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，同時發出生物螢光。這種生物螢光可以通過化學發光儀（luminometer）或液閃測定儀進行精確測量。

螢火蟲螢光素酶催化luciferin發光的最強發光波長為560 nm，而海腎螢光素酶催化coelenterazine發光的最強發光波長為465 nm。在實際應用中，通常將目標基因的5′UTR（非翻譯區）或啟動子序列克隆至螢火蟲螢光素酶基因的上游，或將3′UTR克隆至其下游，通過檢測螢火蟲螢光素酶的表達量來評估啟動子或調控元件的轉錄調控作用。與此同時，海腎螢光素酶（Renilla Luciferase）被用作內參，用于校正細胞數量或轉染效率的差異，從而確保實驗結果的準確性和可靠性。

保存條件: 

-20℃保存（一年有效）

產品組成： 

注意：

1. 細胞裂解液、螢火蟲熒光素酶檢測緩沖液、Renilla 熒光素酶檢測緩沖液在4℃可以保存一個月，-20℃可以保存一年，-80℃可以長期保存。

2. 螢火蟲熒光素酶檢測底物、Renilla 熒光素酶檢測底物，-20℃可以保存半年，-80℃可以保存一年。

產品使用：

1. 細胞裂解：

根據不同的細胞培養板加入適量的細胞裂解液：

1) 對于貼壁細胞：吸盡細胞培養液后用1×PBS潤洗2遍后，去除洗滌液，然后加入細胞裂解液，使裂解液完全覆蓋細胞；對于懸浮細胞：離心去上清后用1×PBS潤洗2遍后離心去上清，加入細胞裂解液。

2) 于振蕩器上室溫裂解20min以裂解充分，然后10000-15000g離心3-5min，取上清用于測定。

注意：

a) 裂解產物可室溫保存6h，-70℃可長期存放（裂解產物不能反復凍融）；

b) 如果螢光素酶的表達水平較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小為100μl；

c) 細胞裂解后可以立即測定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。

2. 工作液準備

將所有組分平衡至室溫。

1) 螢火蟲螢光素酶工作液制備

a) 配置10mg/mL螢火蟲螢光素酶儲存液。2mg螢火蟲熒光素酶檢測底物（NBS0555-C）溶解在200μl超純水中。儲存液-20℃可以儲存6個月，反復凍融5次。

b) 工作液配置：用螢火蟲熒光素酶檢測緩沖液（NBS0555-B）按照1:50稀釋以上儲存液，配制成0.2mg/ml的螢火蟲螢光素酶工作液。

注意：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復凍融超過5次，若單次實驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規格。

2) Renilla熒光素酶工作液制備

a) 配置2mg/ml Renilla熒光素酶儲存液。400μg Renilla 熒光素酶檢測底物（NBS0555-E）溶解在200μl無水乙醇中。儲存液-20℃可以儲存3個月，反復凍融5次。

b) 工作液配置：用Renilla 熒光素酶檢測緩沖液（NBS0555-D）按照1:50稀釋以上儲存液，配制成0.04mg/ml的Renilla熒光素酶工作液。

3. 檢測

1) 取樣品20-100μl（如果樣品量足夠，請加入100μl；如果樣品量不足可適當減少用量，但檢測孔用量需保持一致）。細胞裂解液為空白對照。

2) 加入100μl螢火蟲螢光素酶檢測液，用槍吹打均勻或用其它適當方式混勻后測定RLU（relative light unit）值。

注意：由于該發光為瞬時發光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后，立即進行檢測。

3) 加入100μl Renilla熒光素酶工作液，用槍吹打均勻或用其它適當方式混勻后測定RLU（relative light unit）值。

4. 計算

在以Renilla熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。

注意事項：

1. 熒光染料操作中注意避光進行。

2. 為保證熒光素酶檢測試劑的穩定性，可以采取適當分裝后避光保存的方法，以避免反復凍融和長時間暴露于室溫。

3. 螢火蟲熒光素酶檢測試劑、Renilla 熒光素酶檢測試劑最好現用現配。

4. 細胞裂解液及裂解時間可根據細胞量適當增加、延長。

5. 關于檢測儀器的選擇：能夠檢測化學發光或者生物發光的儀器都可適用于此試劑盒。如果使用多功能酶標儀，為防止各孔之間的干擾，我們推薦使用黑色酶標板（NBH3050），并且不同實驗組之間最好有間隔。

6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。