FITC Phalloidin FITC  標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環(huán)肽及偶聯(lián)物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動(dòng)蛋白），不會(huì)結(jié)合單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）。不像肌動(dòng)蛋白抗體，同時(shí)識(shí)別單體和聚合形式的肌動(dòng)蛋白。

鬼筆環(huán)肽對(duì)大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細(xì)胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計(jì)量比結(jié)合。不像肌動(dòng)蛋白抗體，對(duì)不同物種或來源的肌動(dòng)蛋白親和力會(huì)發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。

鬼筆環(huán)肽使得肌動(dòng)蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強(qiáng)劑。另外，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細(xì)胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對(duì)F-actin染色，且水溶性良好，是非常實(shí)用和方便的探針，對(duì)組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系內(nèi)的F-actin進(jìn)行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標(biāo)記后的F-actin仍維持許多標(biāo)記前的功能。比如，標(biāo)記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動(dòng)。

本品為FITC熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（FITC-Phalloidin），以溶于DMSO的儲(chǔ)存液形式提供，按照100μl/孔（96孔板），總共可做300次。

產(chǎn)品應(yīng)用

1） 對(duì)固定的組織切片和組織細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）的熒光染色；

2） 體外制備穩(wěn)定的熒光肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）；

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，2年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細(xì)胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗(yàn)自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1 FITC Phalloidin（Cat# NBS5830）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、 染色工作液準(zhǔn)備

2.1于實(shí)驗(yàn)前，將低溫保存的FITC-Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。第一次使用請(qǐng)將本品按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃密封避光干燥保存，一年穩(wěn)定。

2.2本品以1000×DMSO儲(chǔ)存液形式提供。開始實(shí)驗(yàn)前，使用含1% BSA的1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如：1μl儲(chǔ)存液加入1ml含1% BSA的PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測(cè)體系，按照100μl/孔來計(jì)算，準(zhǔn)備足量的染色工作液；也可對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細(xì)胞為準(zhǔn)。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應(yīng)用（初次實(shí)驗(yàn)，可在1:1000~1:2000的稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行濃度優(yōu)化）。根據(jù)特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞/組織對(duì)探針的通透性來調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：建議使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲(chǔ)存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。若無現(xiàn)成的BSA，可替代使用1×PBS Buffer（pH 7.4），以能得到理想結(jié)果為宜。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、 染色流程（以96孔板為例）

3.1用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其貼壁生長(zhǎng)達(dá)到70-80%的匯合度。

3.2吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3.3用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10-30min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5【可選】用破膜緩沖液透化細(xì)胞以提高染料的滲透性，室溫處理5min。

3.6用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的FITC-Phallodin染色工作液到每個(gè)孔內(nèi)，完全覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育20-90min。

【注意】：通常情況4℃-37℃都適合用于染色。

3.8用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9【可選】加入100μl 即用型DAPI染色液或其他不同于FITC熒光光譜的細(xì)胞核染色液對(duì)細(xì)胞核復(fù)染，室溫約5min。【注意】：細(xì)胞核復(fù)染時(shí)間可自行調(diào)整；細(xì)胞核復(fù)染也可以放到步驟3.7中進(jìn)行。

3.10用1×PBS Buffer清洗細(xì)胞2-3次，室溫下30s/次。

3.11【可選】加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）到孔內(nèi)保護(hù)熒光。

3.12 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=492/518nm）。若做細(xì)胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項(xiàng)：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時(shí)請(qǐng)注意防護(hù)。

3.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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