?????????????產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

潮霉素B（Hygromycin B），從吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）分離到的一種氨基糖苷類抗生素。通過與30S核糖體亞基結(jié)合，誘導(dǎo)對mRNA模板的錯讀且抑制易位，從而以阻止蛋白合成。潮霉素B能殺死細(xì)菌、真菌和高等真核細(xì)胞。主要用來篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hph載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞）。

對潮霉素B（Hygromycin B）的抗性來源于大腸桿菌潮霉素抗性基因（hph或hyg），該基因能編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycin phosphotransferase），使得潮霉素B發(fā)生磷酸化從而失去活性。目前Hph抗性基因主要有兩種來源，最初來源是大腸桿菌（Escherichia coli），另一來源是潮霉素B產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）。如今，攜帶Hph抗性的載體大多來自大腸桿菌。

我司提供兩種產(chǎn)品形式的潮霉素B。

一種以凍干粉形式提供，貨號分別為：NHB0003-1G，NHB0003-5G，NHB0003-10G。需要配制成儲存液后備用。

一種以溶于PBS的無菌液體形式提供，貨號為NHB0003-20ML，使用更簡單方便。

產(chǎn)品特性

1）化學(xué)名：O-6-Amino-6-deoxy-L-glycero-D-galacto-heptopyranosylidene-(1-2-3)-O-β-D-talopyranosyl(1-5)- 2-deoxy-N3-methyl-D-streptamine

2）同義名：Hygromycin B, from Streptomyces hygroscopicus 潮霉素質(zhì)B，來源于吸水鏈霉菌

3）CAS NO：31282-04-9

4）分子式：C20H37N3O13

5）分子量：527.53g/mol

6）  外觀：類白色至白色粉末

7）純度：≥90%（HPLC）

8）效價：≥1050 U/mg

9）化學(xué)結(jié)構(gòu)：

保存與運(yùn)輸方法

保存：粉末-20℃干燥保存，2年有效。溶液2-8°C避光保存，1年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

使用方法

1. 儲存液制備

1）潮霉素B（粉末形式）：稱取適量粉末溶于1×PBS配制成50mg/ml溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，置于2-8°C避光保存。

2）潮霉素B（溶液形式）：已是無菌儲存液，直接用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到工作濃度即可使用。

2. 建議工作濃度

潮霉素B用來篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長條件和細(xì)胞代謝率而變化。

1）哺乳動物細(xì)胞使用濃度為50-1000 μg/ml，常用篩選濃度為200 μg/ml，最佳濃度需要殺滅曲線來確定。

2）植物細(xì)胞常用濃度：20-200 μg/ml；

3）細(xì)菌常用濃度：20-200 μg/ml；

4）真菌常用濃度：200-1000 μg/ml；

3. 殺滅曲線的建立

建議初次實驗一定要建立殺滅曲線（kill curve），至少設(shè)立5個濃度，篩選到適合自身實驗體系的最佳濃度。

1）將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，鋪足夠的孔以保證后續(xù)的梯度實驗。37℃培養(yǎng)過夜；【注意】：對于需要更高密度以保證活力的細(xì)胞，增加接種量。

2）第二日，用含梯度濃度潮霉素B的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。比如，哺乳動物細(xì)胞常用濃度為50-1000μg/ml，可設(shè)50, 100, 250, 500, 750, 1000μg/m這6個濃度，各3個平行。同時設(shè)置一陰性對照，3個平行。

3）接下來每3-4日更換新鮮的含抗生素培養(yǎng)基。

4）按照固定周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選所需的工作濃度。

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的篩選

1）轉(zhuǎn)染48h后，用含最佳篩選濃度潮霉素B的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞傳代。【注意】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果最好。當(dāng)細(xì)胞密度過高，篩選效率會降低。為了得到較好的篩選效果，建議將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

2）每3-4日更換新鮮的含抗生素培養(yǎng)基。

3）篩選7天后觀察并評估細(xì)胞集落的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這些取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4）挑取5-10個抗性克隆到35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5）之后換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。?????????????