Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專題

背景介紹：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，是最受歡迎的熒光探針之一，用來標記和監測活細胞的細胞功能。具有細胞膜滲透性，一旦進入細胞，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（Calcein），產生強烈的綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因不具細胞膜滲透性，從而能被保留在細胞內。

然而，Calcein, AM的單一熒光使其很難用于多標實驗，特別是Calcein與GFP完全重疊的熒光光譜，使其不可能用在GFP轉染細胞的多色標記實驗。為了克服這一缺陷，我司開發出Calcein Red和Calcein Deep Red兩種類似物，使其能夠替代Calcein AM用在活細胞的標記和功能分析的多重標記研究。

幾種探針的基本特征：

表1 幾種鈣黃綠素（Calcein）系列探針的光譜特征

應用圖片：

圖1：睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosteroni）菌株TK102經Calcein, AM，PI雙染后的熒光顯微檢測圖片。（A）活細胞，僅有綠色熒光；（B）死細胞，僅有紅色熒光；（C）透化處理細胞，中心是紅色熒光，外緣是綠色熒光。

Fig 2. HeLa活細胞經Calcein Red（# MX3013）染色圖。

操作流程（以Calcein Red，NBS2016為例）：

A， 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Red AM（Mw：1015.79）內加入196 μl 細胞培養級別的DMSO即可。儲存液需要根據單次用量分裝，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此種情況下可穩定保存數月。

B，20% Pluronic F-127制備【可選】

稱取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

C，染色步驟

大多數實驗體系中Calcein Red AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein Red AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1）取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Red AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Red AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Red AM溶液不可長期保存，需現配現用。

2）對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

3）去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4）用1/10細胞培養基體積的Calcein Red AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：1）若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低去酯化的Calcein Red泄露到胞外；2）降低探針加載溫度，可能會減少探針區室化現象。

5）用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗；

6）用含合適濾光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的儀器進行檢測。 

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注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。