Calcein Red, AM 鈣黃綠素紅（紅色）

【溫馨提示】：見我司整理的Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專題，尋找最合適波長的鈣黃綠素活細胞探針。

產品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性最受歡迎的活細胞熒光染料，用來標記和監測活細胞功能，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM單一顏色使其不能將其用在多重標記實驗，比如，其無法和GFP轉染細胞聯合使用，因光譜一致。為了解決這一應用缺陷，我司特別開發出Calcein Red, AM，實現聯合Calcein, AM對活細胞的標記和功能分析。

同樣原理，Calcein Red, AM自身無熒光，具有細胞膜滲透性。一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素紅（Calcein Red），能與胞內鈣離子結合，產生強烈的紅色熒光（Ex/Em=560/574），用標準的TRITC/Cy3濾片設置檢測。

產品特性：

1）  同義名：Calcein Red Acetoxymethyl ester鈣黃綠素紅乙酰甲酯；

2）  分子量：1015.79

3）  純度：≥90%（HPLC）

4）  Ex/Em：560/574nm

5）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥保存，避免強光直射，有效期一年。

產品使用：

A、 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Red AM（Mw：1015.79）內加入196μl細胞培養級別的DMSO即可。儲存液需要根據單次用量分裝，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此種情況下可穩定保存數月。

B. 20% Pluronic F-127制備【可選】

稱取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

C. 染色步驟

大多數實驗體系中Calcein Red AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein Red AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1. 取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Red AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Red AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Red AM溶液不可長期保存，需現配現用。

2. 對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

3. 去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4. 用1/10細胞培養基體積的Calcein Red AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：1）若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低去酯化的Calcein Red泄露到胞外；2）降低探針加載溫度，可能會減少探針區室化現象。

6. 用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗；

7. 用含合適濾光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的儀器進行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein Red AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Red AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Red AM工作液必須現配現用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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