Fluo-8, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純

【溫馨提示】：見我司整理的鈣離子載體/探針（Calcium ionophores/indicators）產品專題。

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產品簡介：

Fluo-8，是目前最亮的可見光激發波長Ca²⁺熒光探針，其熒光強度比Fluo-4強兩倍，比Fluo-3強四倍。Fluo-8具中等程度的Ca²⁺親和力，幾乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上幾乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，Fluo-4便捷的光譜檢測特性，與Ca²⁺結合后的最大激發波長為490nm，最大發射波長為514nm。而且具有改善的細胞載入和Ca²⁺響應能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4嚴格要求在37℃孵育，此特征使其更適用于HTS高通量篩選實驗。Fluo-8應用廣泛，與許多細胞系和靶向樣本兼容，不會受配體或靶標本身信號干擾。Fluo-8可通過激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光顯微鏡等來檢測胞內鈣離子水平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8，從而滯留在胞內以發揮相應生理功能。本品以50μg小包裝的凍干粉形式供貨，用于細胞內Ca²⁺水平檢測時，常用濃度為1-5μM。

基本特性：

1）同義名：Fluo-8, Acetoxymethyl Ester;Fluo-2, AM; Fluo-2 Medium Affinity, Acetoxymethyl Ester;

2）化學名：Bis(acetoxymethyl) 2,2'-((4-(6-(acetoxymethoxy)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(bis(2-acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)phenoxy)ethoxy)phenyl)azanediyl)diacetate

3）分子式：C50H50N2O23

4）分子量：1046.93

5）最大激發/發射波長：490/514 nm（Ca²⁺結合）

6）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

7）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期一年。

產品使用： 【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據具體的實驗條件做出調整。

A、試劑準備

1. 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1. 用無水DMSO溶解Fluo-8, AM配制成1-5mM的儲存液，或將已配好的Fluo-8, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-8,AM中加入11.9μl無水DMSO）。

2. 用HHBS或其他生理緩沖液將Fluo-8, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10μM的工作液，提前加入適量的20% Pluronic F-127溶液，使其終濃度為0.02%。

【注①】：Fluo-8, AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fluo-8, AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

【注③】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8, AM在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8, AM的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

3.【可選】如果細胞內含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養基后需要重新調整pH。

4. 將準備好的Fluo-8, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。37℃或者室溫孵育20-60min。

【注①】：關于孵育的時間，如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

【注②】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區室化現象。

5. 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）替換，以去除多余探針。

6. 用適當的儀器如激光共聚焦、流式細胞儀、熒光酶標儀，以及波長Ex/Em=490/520 nm來進行檢測。

【注①】：Fluo-8, AM進入胞內后，經酯酶降解形成Fluo-8，并不是以共價結合的形式滯留在細胞質內。因此不可對加載染料的活細胞進行固定處理，再進行Ca²⁺水平檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fluo-8, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fluo-8, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內使用。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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