Cal-590 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

鈣離子測定在各種生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，與鈣離子結(jié)合從而表現(xiàn)出光譜反應(yīng)的熒光探針使得研究人員能夠觀察胞內(nèi)游離鈣離子水平變化，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)板來檢測。
新一代鈣離子熒光探針：Cal-520，Cal-590和Cal-630是最強(qiáng)大且均一的細(xì)胞內(nèi)鈣流（Calcium mobilization）測定用熒光探針，與傳統(tǒng)的鈣離子探針（比如：Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細(xì)胞內(nèi)滯留性。
Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM具有細(xì)胞膜滲透性，能夠預(yù)加載進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞候，親脂阻斷基團(tuán)AM被酯酶裂解，產(chǎn)生帶負(fù)電荷的熒光染料，留在細(xì)胞內(nèi)部。一旦與鈣離子結(jié)合后，它們的熒光顯著加強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞被激動(dòng)劑刺激后，受體發(fā)出細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的信號(hào)，從而使得Cal-520，Cal-590和Cal-630的熒光增加。Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM的高靈敏度以及>100倍的熒光增強(qiáng)使其成為胞內(nèi)鈣離子測定的理想探針。高信噪比和更加的胞內(nèi)滯留性使其成為評估GPCR和鈣離子通道靶標(biāo)以及篩選對應(yīng)激動(dòng)劑和拮抗劑的優(yōu)秀工具。

Cal-520，Cal-590和Cal-630基本定位在細(xì)胞質(zhì)，不像Rhod-2主要定位在線粒體。Cal-590和Cal-630的長激發(fā)/發(fā)射波長使其為完美的鈣離子探針，能夠與綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記細(xì)胞兼容多色檢測。另外，Cal-520，Cal-590和Cal-630也與絕大多數(shù)現(xiàn)存的熒光儀器兼容。Cal-520在488nm處被良好激發(fā)，用FITC濾片檢測；Cal-590經(jīng)優(yōu)化在555nm處被良好激發(fā)，用TRITC/Cy3濾片檢測；Cal-630經(jīng)優(yōu)化在594nm處被良好激發(fā)，用Texas Red濾片檢測；

產(chǎn)品特性：

1）同義名：Cal-590, Acetoxymethyl Ester;

2）分子量：分子量：1266.81

3）解離常數(shù)：K_d=561 nM

4）溶解性：DMSO

5）Ex/Em：574/588

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg  Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無水DMSO溶解Cal-590 AM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Cal-590 AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Cal-590 AM中加入9.8μl 無水DMSO）。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將Cal-590 AM+DMSO儲(chǔ)存液稀釋到含0.04% Pluronic F-127的10-20μM染色工作液。

【注①】：添加一定量的20% Pluronic F-127溶液到Cal-590 AM+DMSO儲(chǔ)存液，使Pluronic F-127的濃度約為0.04%。Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長期保存。

【注②】：Cal-590 AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注③】：Cal-590 AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3） 【可選】如果細(xì)胞內(nèi)（比如CHO細(xì)胞）含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2mM）可能需要加入上述染色工作液內(nèi)（在孔內(nèi)的最終濃度為0.5-1mM），以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：我司提供多種丙磺舒：包括水溶性的丙磺舒（NBS2008-154MG），能降低有機(jī)溶劑的使用。

4） 加入等體積的染色工作液到細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃孵育60-90min。然后，室溫再孵育30min。

【注①】：某些細(xì)胞系探針的加載時(shí)間長于2h能提供更好的信號(hào)。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 之后在HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）中，用合適的激發(fā)/發(fā)射波長來檢測熒光（見產(chǎn)品特性：Cal-590 AM的激發(fā)和發(fā)射光譜）。

【注①】：對于熒光顯微鏡檢測，建議用TRITC/Cy3濾片來檢測，建議用黑框/透明底的細(xì)胞培養(yǎng)板。

【注②】：對于熒光酶標(biāo)儀檢測，建議用激發(fā)波長：540nm，發(fā)射波長590nm，cut-off波長570nm來檢測，建議用黑框/透明底的96孔板；

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底

3.      Cal-590, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Cal-590, AM第一次使用，建議儲(chǔ)存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時(shí)間內(nèi)使用

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

附錄I Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣離子探針的波長和鈣離子結(jié)合特性