Cyanine7.5 NHS Ester Cy7.5 NHS酯（脂溶性）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

花菁類染料（Cyanine Dyes）是一種在兩個(gè)氮原子間含聚亞甲基橋鍵且攜帶一非定域電荷的分子。歸其結(jié)構(gòu)特征，花菁素具有極其高的消光系數(shù)通常高于100,000 L?mol-1?cm-1。不同的替代基允許控制發(fā)光團(tuán)的性能比如吸光波長(zhǎng)，光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度。例如，通過(guò)選擇不同長(zhǎng)度的聚亞甲基橋鍵能夠控制吸光和熒光波長(zhǎng)：花菁素越長(zhǎng)，吸光和發(fā)射波長(zhǎng)更高，高達(dá)至近紅外區(qū)。

在生命科學(xué)領(lǐng)域廣受歡迎的花菁類染料由美國(guó)卡耐基梅隆大學(xué)（CMU）的Alan Waggoner教授和同事于二十世紀(jì)90年代早期研發(fā)應(yīng)用。這些染料呈現(xiàn)出低的生物分子非特異性結(jié)合，并由其巨大的消光系數(shù)和良好的量子產(chǎn)量產(chǎn)生明亮的熒光。目前商業(yè)化可提供各種反應(yīng)性衍生物，比如點(diǎn)擊化學(xué)用的N-羥基琥珀酰亞胺酯，馬來(lái)酰亞胺，疊氮化物和其他衍生物。

目前花菁染料常以兩種異構(gòu)體的形式供應(yīng)：一種非磺化的花菁類染料和磺化的花菁類染料，對(duì)于許多應(yīng)用，兩種是可以互相替換的，因其光譜屬性基本相同。兩種染料都可用于DNA和蛋白質(zhì)等生物分子的標(biāo)記。兩者的區(qū)別在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水環(huán)境中標(biāo)記，無(wú)需有機(jī)共溶劑，且在水中不易聚集。

Cyanine7.5是一種脂溶性的，近紅外（NIR）發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料。Cyanine7.5 NHS Ester是Cyanine7.5的胺反應(yīng)活化酯，用于標(biāo)記生物分子比如蛋白和多肽的氨基基團(tuán)，從而通過(guò)近紅外成像來(lái)觀察這些分子的體內(nèi)分布。Cyanine7.5 NHS Ester需要在有機(jī)共溶劑的體系內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。

產(chǎn)品特性：
1）同義名：Cyanine7.5 NHS ester; Cy7.5 NHS ester; Cy7.5 SE; Cyanine7.5 N-hydroxysuccinimide ester; Cy7.5琥珀酰亞胺酯；Cy7.5 NHS酯；
2）分子式：C48H51IN2O4
3）分子量：846.85g/mol
4）純度：≥95%
5）外觀：深綠色固體
6）溶解性：溶于DMF，DMSO，幾乎不溶于水
7）Ex/Em：778/795 nm
8）消光系數(shù)：200, 000 L?mol-1?cm-1

9）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20°C避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

【注意】：Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4~12之間熒光強(qiáng)度最高。F/P過(guò)高，熒光探針會(huì)自我淬滅并且影響生物分子的活性。CyDye NHS在pH 8.5~9.4內(nèi)標(biāo)記抗體10min，F/P可達(dá)5~6。但在pH 7.0內(nèi)幾乎無(wú)反應(yīng)。我司內(nèi)部使用Cy3NHS標(biāo)記Anti-GST抗體發(fā)現(xiàn)按1:1，1:5，1:10，和1:20標(biāo)記得到的F/P分別為0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、 水溶性Cy3NHS標(biāo)記Anti-GST抗體【其它CyDye NHS參考此方法進(jìn)行并做適當(dāng)摸索】

商業(yè)化購(gòu)買(mǎi)的抗體如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明膠等），或溶于帶氨基的緩沖液，會(huì)影響標(biāo)記。需在標(biāo)記前對(duì)抗體進(jìn)行純化。

1. 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室溫或4℃透析4h。

2. 換用1L新鮮的0.15M NaCl溶液，4℃透析過(guò)夜。

3. 第二天再換用1L 0.1M NaHCO₃（pH 8.3），4℃透析4h。

4. 【可選】用0.22μm低吸附濾膜過(guò)濾透析后的抗體溶液。

5. 用0.1M NaHCO₃（pH 8.3）稀釋少量的抗體，于280nm測(cè)其紫外吸收值并計(jì)算標(biāo)記抗體的總量（IgG抗體摩爾吸光系數(shù)為170,000 at 280nm）。

6. 用DMSO配制Cy3 NHS（MW:765.95），濃度為10mg/ml。根據(jù)CyDye NHS和抗體的使用比值（比如1:20）來(lái)計(jì)算所需要染料的體積。然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)于暗處低速攪拌，室溫45min。

7. 用1L 0.15M NaCl溶液，常溫或4℃避光透析4h，以除去未標(biāo)記上的Cy3 NHS。

8. 換用新鮮的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析過(guò)夜。

9. 換用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室溫或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析過(guò)夜。

10. 【可選】用0.22μm低吸附濾膜過(guò)濾透析后的抗體溶液。

11. 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體，測(cè)定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）處的紫外可見(jiàn)吸光度。

12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。

【F/P計(jì)算】：

Cy3在552nm下的摩爾吸光系數(shù)為150,000L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不同。Cy3本身在280nm處的吸收是552nm處的8%。按照以下公式計(jì)算F/P值。

[Cy3] = A552/150000; [Antibody] =[A280-(0.08×A552)]/170000

F/Pfinal =[Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A552]/[A280-(0.08×A552)]

二、 水溶性Cy5 NHS標(biāo)記（D-ser2）- Leu-Enkephalin【其它CyDye NHS參考此方法進(jìn)行并做適當(dāng)摸索】

1. 低溫保存的Cy5 NHS置于室溫回溫至少20min。往1mg粉末內(nèi)加入400μl高品質(zhì)無(wú)水DMSO充分溶解。同樣，低溫保存的玻璃瓶裝的（D-ser2）- Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室溫回溫后加入400μl高品質(zhì)無(wú)水DMSO充分溶解。將400μl Cy5 NHS加入400μl多肽內(nèi)。【染料與多肽通常質(zhì)量比1:1】。

2. 再加入15μl三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物，過(guò)夜。【若多肽穩(wěn)定性較弱，則于4℃反應(yīng)過(guò)夜】。

3. 用HPLC純度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上樣注入2×400μl，30min梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70：30，流速4ml/min。（對(duì)不同的多肽選擇不同的合適HPLC梯度流動(dòng)相）

4. 收集適當(dāng)?shù)纳珟Х澹瑯?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長(zhǎng)。

5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

6. CyDye標(biāo)記的蛋白/多肽穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4℃可避光保存2月，更長(zhǎng)保存需加入等體積甘油-20℃避光保存。

【F/P計(jì)算】：

Cy5在650nm下的摩爾吸光系數(shù)為250,000L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不同。Cy5本身在280nm處的吸收是650nm處的5%。按照以下公式計(jì)算F/P值。

[Cy5] = A650/250000; [Peptide] =[A280-(0.05×A650)]/170000

F/Pfinal =[Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A650]/[A280-(0.05×A650)]

注意事項(xiàng)：

1.      Cyanine7.5 NHS Ester是脂溶性的，先用有機(jī)溶劑如DMSO，DMF配制成母液后，再加入水溶性反應(yīng)溶液內(nèi)。純有機(jī)溶劑的母液置于-20℃避光保存，最好2周內(nèi)用完，避免反復(fù)凍融。水溶性反應(yīng)液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，盡快用完。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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