Coelenterazine 400 a 腔腸素400a

【溫馨提示】：見我司提供的活體成像底物-腔腸素及衍生物產品專題。

產品簡介：

腔腸素（Coelenterazine）是在水生生物中發現的一種發光基團（luminophore），是許多熒光素酶的作用底物，包括海腎熒光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和藪枝蟲熒光素酶（Obelia luciferase），和發光蛋白包括水母發光蛋白（Aequorin）的構成之一。其作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶，在含分子氧的條件下，氧化腔腸素產生高能量的中間產物，在此過程發射藍色光，光波長在450~480nm。而甲蟲（或螢火蟲）熒光素/熒光素酶（FLuc）系統不同，其在含分子氧的條件下，還需要ATP和Mg²⁺的存在才能同時發光，光波長在550-570nm。正由于生物發光信號和底物的差異，RLuc常常與FLuc聯合用于多重轉錄報告基因研究，或用作Fluc系統內螢火蟲熒光素酶轉染的內參。

腔腸素應用甚是廣泛，包括：1）活細胞或組織的鈣離子檢測；2）細胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學發光檢測；3）基因報告基因檢測；4）動物活體檢測；5）ELISA和生物發光共振能量轉移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）藥物高通量篩選（HTS）。

天然腔腸素（Coelenterazine Native，CTZ-Native）是自然界中存在最豐富的一種腔腸素，也是目前應用最普遍的一種標準底物。不僅是脫輔基水母發光蛋白（APO）的底物，也是海腎熒光素酶（Rluc）和分泌型膜錨定熒光素酶（Gluc）等熒光素酶的作用底物。前者用于檢測鈣離子濃度，后者用作熒光素酶的報告基因檢測系統。還可用于生物共振能量轉移BRET，細胞或組織內的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子水平（ROS）的化學發光檢測等。

腔腸素400a（Coelenterazine 400a，CTZ 400a），常稱為DeepBlue C，是一種天然腔腸素衍生物，是一款良好的海腎熒光素酶（Rluc）底物，但不適合用作分泌型膜錨定熒光素酶（Gluc）底物。可用來實時監測鈣離子濃度，報告基因分析，以及用作生物發光共振能量轉移（BRET）的首選底物。腔腸素400a的最大射波峰值約在400nm，從而對GFP受體的發射峰干擾最小。腔腸素400a用在BRET2體系，該體系通常用來評估蛋白-蛋白相互作用，包括涉及G蛋白偶聯受體介導的藥物細胞信號通路分析，是一種有效的藥物開發和篩選工具。

產品描述：

1）CAS NO：70217-82-2

2）化學名：2,8-Dibenzyl-6-phenyl-imidazo[1,2a]pyrazin-3-(7H)-one; 6-phenyl-2,8-bis(phenylmethyl)-imidazo [1,2-a]pyrazin-3(7H)-one;

3）同義名：CTZ 400a; 1-bisdeoxycoelenterazine; di-dehydrocoelenterazine; DeepBlueCTM; 腔腸素400a；

4）分子式：C26H21N3O

5）分子量：391.5 g/mol

6）純度：>97%

7）外觀：黃色至橙色固體

8）溶解性：溶于甲醇或乙醇，不要溶于DMSO

9）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，且保存于惰性氣體內。至少一年有效。

產品使用：

一、 腔腸素400a的溶解事項

1）腔腸素400a不溶于水，接觸到空氣，水分或任何氧化劑都不穩定。溶于甲醇或乙醇，千萬不要溶于DMSO，因會發生未知反應引起腔腸素400a的快速降解并生成未知的代謝產物。

2）毒性最小的溶劑是無水乙醇，可溶解粉末配制成0.1-1mg/ml溶液，之后加入需要的緩沖液，盡量保持緩沖液pH小于7.0，因堿性條件會快速降解腔腸素400a，有時沉淀會立即產生。

二、 腔腸素400a的保存事項

最好在使用前，才用無水乙醇溶解腔腸素400a粉末，然后用所選的緩沖液稀釋并混勻。此時配好的工作緩沖液需靜置20-30min使其穩定（因部分底物會發生自氧化）后才進行體外實驗。該工作液能穩定保存幾個小時（室溫3-4h），僅微弱的信號衰減可能發生。

不建議將腔腸素400a的乙醇溶液置于-20℃或-70℃保存，因天然腔腸素及任何衍生物含有一個高能量的二氧雜環丁酮環形結構，即使在低溫條件下都會自發降解。

三、 腔腸素工作液的配制

稱取1mg腔腸素400a粉末溶解于1ml乙醇（或甲醇）中配置成濃度為1mg/ml的母液。在使用時 需將母液用合適的緩沖液（比如PBS）稀釋成需要濃度的工作液。比如常用的工作液濃度是100μM，可使用391.5ul的1mg/ml 的母液用PBS稀釋到10ml，得到一個100uM的溶液。

BRET 生物發光共振能量轉移（可根據具體實驗發生變動） 詳細步驟可參考文獻：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer:an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012)。

本步驟以Rluc的融合蛋白作為能量供體，YFP的融合蛋白作為能量受體，兩者同時電轉化進入細胞，并通過加載腔腸素400a 底物來啟動氧化反應，通過分析兩者BRET信號來研究兩個蛋白之間的相互作用。

1. 按照正常流程將能表達兩個融合蛋白的質粒，按照3:1的比例（YFP:Rluc）共電轉染進入細胞。

2. 轉染后24h進行BRET信號的檢測。吸去培養液（留約30μl）后，將96孔板放到熒光酶標儀上。

3. 至少在測定前15min準備腔腸素400a工作液。

4. 用超純水清洗注射泵后，讓泵開始自動吸取配制好的400a工作液，按照每孔70μl工作液的量順序加入，使得每孔中底 物的終濃度為30μM。進樣結束后，孵育2min。之后立即進行雙波長熒光信號讀數，即Rluc信號（485nm）和BRET 信號（535nm）。

BRET信號值計算

為了能夠進行數據評估，轉染細胞的Rluc信號（485nm）應當超過非轉染對照細胞的（平均值+9×標準誤差）的區間。

1. BRET–ratio（BRET 信號比）基于以下等式進行計算，

R=（I_A/I_D）-cf

R代表BRET比值，ID表示受體YFP熒光信號的強度（535nm），IA表示供體Rluc熒光信號的強度（485nm），cf表示校 準因子（BRETcontrol/RluccontrolD），對照樣本是指共轉染YFP 融合蛋白質粒和不含供體第二個研究蛋白的Rluc載體的細胞熒 光信號。

2. 陽性對照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值為1.0。

3. 若蛋白之間有陽性反應，必須檢測到：8組蛋白樣本中至少有一組能夠產生超過設定閾值0.1以上的BRET信號比值。

附錄1 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性：

附錄2天然腔腸素及其衍生物的應用差異：

注意事項：

1.      腔腸素（Coelenterazine， CTZ）及衍生物最好以完全凍干粉的狀態保存在惰性氣體內，密封后置于-20℃或-70℃長期避光保存。管內即使有微量空氣，也會隨著時間慢慢氧化腔腸素使其活性喪失。

2.      腔腸素（Coelenterazine， CTZ）及衍生物不建議以儲存液的形式保存，最好于實驗前配制新鮮的溶液。不建議將配好的腔腸素溶液儲存在-20℃或-70℃，因其具有一個高能量的二氧雜環丁酮環形結構，即使在低溫條件下都會自發降解。

3.      商業化腔腸素的種類繁多，有天然腔腸素，以及各種腔腸素衍生物（比如，腔腸素h，腔腸素400a，腔腸素e，腔腸素f，腔腸素hcp）。它們對鈣離子的親和力，光譜特性，以及應用傾向上會有差異，詳見附錄1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性，附錄2—天然腔腸素及其衍生物的應用差異選擇適當的產品。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。