MTT 噻唑蘭

產(chǎn)品簡介：

噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,簡稱MTT，CAS：298-93-1），也稱作溴化噻唑藍四氮唑，是一種黃色染料，已經(jīng)廣泛替代傳統(tǒng)的臺盼藍染色法或者放射性同位素插入法，用來檢測細胞活力、細胞增殖以及毒性分析。MTT是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有細胞膜滲透性。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M入的MTT還原成為水不溶性的深藍色MTT-甲臜結(jié)晶，而死細胞不具此功能。甲臜結(jié)晶不能穿透細胞膜，因此沉積在處于增殖且未受損傷的細胞內(nèi)。甲臜結(jié)晶可用DMSO或者酸化的異丙醇溶解，酶標儀測定的570 nm吸光度能反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細胞數(shù)目成正比，因此可用來評估細胞存活狀況。MTT也可用在免疫組化和免疫細胞化學(xué)研究，也可用于NAD水平檢測。MTT經(jīng)快速還原為甲臜后，能夠螯合鎳，銅和鈷離子。鈷螯合物可參與細胞氧化系統(tǒng)。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：298-93-1

2）英文同義名：3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide;Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide;Thiazoyl blue tetrazolium bromide;

3）中文同義名：溴化噻唑藍四氮唑；3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍；

4）分子式：C18H16N5SBr

5）分子量：414.3 g/mol

6）外觀：淡黃色至橙色粉末

7）純度：≥98%

8）溶解性：溶于水（5 mg/ml）

9）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

4℃避光保存，5年有效。

產(chǎn)品使用：

細胞生長的培養(yǎng)條件會影響檢測結(jié)果，因此進行MTT檢測時需考慮這些條件，包括：培養(yǎng)時間，傳代次數(shù)以及生長培養(yǎng)基的成分等。一般情況，48-72h培養(yǎng)時間下，最初鋪板的細胞密度可控制在5000-10,000/孔。

【注意】：最終檢測的培養(yǎng)液內(nèi)含有酚紅會嚴重影響檢測結(jié)果。推薦MTT檢測時細胞培養(yǎng)在無酚紅環(huán)境下，也可以在進行MTT孵育的時候改用無酚紅培養(yǎng)液。

A．儲存液配制

1）MTT儲存液

生化研究中，常配制成5mg/ml的儲備液。MTT最好現(xiàn)配現(xiàn)用，可以稱取MTT 0.5g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃避光短時間保存。建議小劑量分裝放到-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融，至少6個月有效。

2）SDS-HCl溶液（MTT終止液）

取10ml 0.01 M HCl加入1g SDS，顛倒混勻或者超聲使其完全溶解，此時即為終止液。建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

B．MTT細胞增殖檢測【以96孔板為例】

1）接種細胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液配制成單個細胞懸液，調(diào)整細胞密度，以每孔5000-10, 000個細胞接種到96孔板，每孔體積100μl，培養(yǎng)板的邊緣孔用無菌PBS填充。設(shè)置空白對照孔（不含有細胞）。

2）37℃，5% CO₂，培養(yǎng)24-72h。

3）【可選】：對于貼壁細胞，去除舊的培養(yǎng)液，更換100μl/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）；對于懸浮細胞，離心96孔板，去除盡可能多的上清液。然后加入100μl/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）重懸細胞；

4）每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），加樣時盡量勤換槍頭，控制加量誤差。

5）水平搖床上低速混勻1min后，放入37℃培養(yǎng)箱孵育4h。【注意】：對于高密度的細胞（>100,000 cells/孔）可縮短孵育時間至2h。

6）對于貼壁細胞，直接吸掉舊的培養(yǎng)液，避免槍尖刮破單細胞層。對于懸浮細胞，離心收集細胞，去除培養(yǎng)液。

7）加入100μl/孔SDS-HCl溶液，用槍充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4h。【注意】：更長的孵育時間會降低檢測靈敏度。

8）孵育結(jié)束，放置在酶標儀上搖勻后，選擇570nm，測定吸光度。記錄結(jié)果，比色以空白調(diào)零。

【注意】：對于細胞毒性檢測，以未經(jīng)藥物處理細胞的OD值為100%，然后計算藥物處理細胞所占的比率（x），公式如下：OD（未經(jīng)藥物處理細胞）/OD（藥物處理細胞）=100%/x。然后建立直方圖。

注意事項：

1.      溶解甲臜結(jié)晶的有機溶劑具有毒性，使用時注意防護。

2.      MTT有致癌性應(yīng)小心操作；MTT溶液4℃保存不可超過1周，否則會發(fā)生降解并導(dǎo)致檢測結(jié)果錯誤。

3.      MTT法屬于半定量檢測，只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內(nèi)。

4.      建議用平底的酶標板來做MTT檢測，僅當要求細胞生長量比較高的情況下首推組織培養(yǎng)級的培養(yǎng)板。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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