DAF-FM DA (5mM in DMSO)一氧化氮（NO）熒光探針

產品簡介：

DAF-FM DA，也稱為DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于檢測和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的熒光探針。具有細胞膜滲透性，無熒光。一旦進入細胞后，被細胞內的酯酶催化形成不具有膜滲透性的DAF-FM。DAF-FM本身僅有弱熒光，但和NO反應后可產生強烈熒光，最大激發波長為495nm，最大發射波長為515nm。任何可以檢測熒光素的儀器都能檢測，包括流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光酶標板和熒光計。

與傳統的NO熒光探針—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要優勢：a）DAF-FM-NO加合物的光譜特性在pH 5.5以上不受pH影響；b）DAF-FM-NO加合物具有更顯著的光穩定性，意味其提供更多的時間來捕捉圖像；c）DAF-FM對NO的檢測靈敏度更高，前者的檢測下限~3nM；而DAF-2的檢測下限~5nM。

本品以溶于DMSO的儲存液形式提供，濃度為5mM。使用簡單，只需用合適的生理緩沖液或培養基稀釋到相應的工作濃度即可。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

本品適合細胞內NO的檢測，可以進行實時檢測。若收集細胞后再裝載探針，通常至少能檢測100個樣品。

產品特性

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化學名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同義名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2?,7?-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同義名：DAF-FM二乙酸鹽；二氨基熒光素-FM二乙酸鹽；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟熒光素二乙酸鹽；3-氨基, 4-氨甲基-2?,7?-二氟熒光素二乙酸鹽；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 純度：≥98%（HPLC）

8） 外觀：無色至淡黃色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

產品組成：

產品使用：

一、 工作液制備

取適量的母液用本試劑盒提供的稀釋緩沖液或自行準備的新鮮培養基（不含血清和酚紅）稀釋到工作濃度，比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀釋到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混勻。

【注意】工作液必須現配現用，實驗結束后需丟棄多余探針。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，為此，請盡快用完。

【注意】探針的最佳工作濃度需根據自身的細胞類型或實驗條件來摸索，或參考文獻。一般情況下，在保證獲得足量熒光信號的前提下，盡量選擇最小濃度的探針，這樣可盡量減少酯的水解副產物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探針裝載

對于刺激時間較短（通常為2h以內）的細胞，先裝載探針，后用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6h以上）的細胞，先用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

2.1 探針原位裝載（僅適用于貼壁細胞）

a）去除細胞培養液，加入適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入工作液體積為1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。

2.2 收集細胞后探針裝載

a）細胞收集后，用適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）重懸細胞，使得細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在離心管內進行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。

d）直接用適當的陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后再刺激細胞。

三、 熒光檢測

3.1對于原位裝載探針的樣品：可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察（用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對較差），或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

3.2 對于收集細胞后裝載探針的樣品：可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

3.3 參數設置：使用495nm激發波長，515nm發射波長，實時、逐時間點或單時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DAF-FM-NO反應產物的熒光光譜和熒光素（Fluorescein）非常相似，可以用檢測熒光素的參數設置進行檢測，用檢測FITC的參數設置進行檢測也可以。

四、 其他說明

4.1 上述步驟推薦DAF-FM DA的工作濃度為5μM。對于某些細胞，如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時DAF-FM DA的工作濃度為1-2.5μM。相反，如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調整為10μM，以提高檢測的靈敏度。

4.2 探針裝載的時間可以根據情況在15-60min內適當進行調整。

注意事項：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等較低溫度下會凝固而粘附在離心管管底、管壁或管蓋內，可在25℃溫育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，請置于室溫或25℃溫育片刻直至完全溶解后，低速離心后，根據單次用量分成小包裝后-20℃避光干燥保存，避免反復凍融。

3.      BSA和酚紅對DAF-FM的熒光檢測有干擾，請避免體系內含有這些組分。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關產品：