ROSGreen^TM H2O2 Probe 過氧化氫熒光探針

產品簡介：

過氧化氫（Hydrogen peroxide, H2O2）是一種反映氧代謝副產物，用于許多氧化應激相關態的關鍵調節劑，參與人體大量的生理和病理活動，比如哮喘、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、神經性衰退疾病和唐氏綜合征等，但目前對H2O2生成、積累、運輸和功能的分子機制仍了解很少，最大的限制在于缺乏靈敏且特異性H2O2探針，用于活細胞研究。目前能得到的H2O2反應性探針的缺陷包括1）來自其他ROS比如過氧亞硝基陰離子（ONOO-）、過氧化基（ROO?）、超氧化物（?O2–）的背景熒光干擾；2）對外源活化酶的需求；3）水缺乏水溶性或不兼容于水溶體系；4）以及紫外區域的激發光譜特征等。

本ROSGreen^TMH2O2Probe正是克服以上缺陷開發的一款過氧化氫（H2O2）選擇性探針。探針本身無熒光，可見光區域內無吸收峰。一旦接觸H2O2，瞬間激發熒光增加并伴隨可見波長吸收帶的生成（Ex/Em= 490/514nm）。因其二元的吸收/發射熒光反應，此探針具有較大的動力學范圍。與相似的ROS比如O2–，NO，或OCl-相比，ROSGreen^TMH2O2Probe對H2O2呈現出＞100倍（100-fold）的選擇性。

保存條件: 

-20oC避光干燥保存，至少1年有效。

產品使用：

1、儲存液制備

將低溫保存的產品從冰箱取出，置于室溫回溫至少20min。低速離心3-5min。之后往瓶內加入適量無水DMSO充分溶解配成2~5mM儲存液（比如，1mg ROSGreen^TMH2O2 Probe（Mw: ~ 600）加入333μl DMSO，充分溶解混勻后即得到5mM儲存液）。按照單次用量分裝凍存，避免反復凍融，至少3個月穩定。

2、工作液準備

正式實驗前，或取粉末按照【儲存液制備】用DMSO溶解，或于室溫融化一管DMSO儲存液。

2.1 對于溶液H2O2測定，按照2~20μM工作液濃度制備2×工作液，用20mM Hepes緩沖液或其他緩沖液（pH 7.0）稀釋儲存液。工作液現配現用。建議使用5μM終濃度的ROSGreen^TMH2O2Probe，測定溶液體系中H2O2濃度。

2.2 對于細胞H2O2測定，按照2~20μM工作液濃度制備1×工作液，用含20mM Hepes緩沖液的HBSS，pH 7.0 或PBS稀釋儲存液。工作液現配現用。

3、 上清液H2O2測定

【以下為溶液H2O2測定的推薦步驟，僅作參考，請根據具體需求做優化調整?！?/span>

3.1 于96孔板，加50μl 2×ROSGreen^TMH2O2Probe工作液到每個孔（H2O2標準、空白對照、待測樣本）內使總的測定體積為100μl/孔?！咀⒁猓簩τ?span>384孔板，加25μl樣品和25μl 2×ROSGreen^TMH2O2Probe工作液，使得測定體積為50μl/孔?！?/span>

3.2 室溫避光孵育反應體系15~60min。

3.3 熒光酶標板內監測用熒光增強，Ex/Em=490/525nm。

3.4 空白孔（只含有反應緩沖液）的熒光用作對照，其他孔的熒光值需減掉空白對照孔熒光。

4、活細胞H2O2測定

【ROSGreen^TMH2O2Probe能主動擴散進入活細胞，且能反映胞內H2O2微摩爾濃度變化。以下是推薦的活細胞H2O2顯微成像檢測步驟，僅作參考，可根據具體需求優化調整?！?/span>

4.1 按照步驟2.2配制1×ROSGreen^TMH2O2Probe工作液。工作液現配現用。

4.2 按照實驗要求處理細胞。

4.3 用1×ROSGreen^TMH2O2Probe工作液避光孵育細胞5~60min或適合自身需求的時間。用PBS清洗細胞2次。

4.3 用熒光酶標板（底部讀數模式）監測熒光增強，Ex/Em=490/525nm。或者用熒光顯微鏡的FITC通道成像檢測熒光增強。

染色示例：

Costar 黑色96孔培養板內CHO-K1活細胞用ROSGreen^TMH2O2Probe的染色圖。

圖A：對照細胞；圖B：用H2O2（100μM）處理5min后的細胞。

注意事項：

1.      本品的DMSO儲存液需分裝成單次用量后，-20oC避光保存，避免反復凍融。所有工作液現配現用。

2.      整個操作過程中注意避光。

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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