重組霍亂毒素B亞基（CF488A標(biāo)記，綠色熒光）

Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated

產(chǎn)品簡介：

霍亂毒素（Cholera toxin，CTX）是霍亂弧菌產(chǎn)生的毒力因子，會(huì)引起嚴(yán)重腹瀉以及人體脫水。CTX屬于AB5亞基家族。天然六聚體蛋白含兩個(gè)亞基，分子量約85kDa。由一個(gè)A亞基（約27.2kDa）和五個(gè)B亞基（約11.6kDa/亞基）組成，B亞基以五聚體環(huán)的方式排列，呈明顯的五度對(duì)稱，負(fù)責(zé)毒素識(shí)別并吸附細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。A亞基催化刺激性G蛋白α亞基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亞基。Gαs的活化引起腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性增加，進(jìn)而促使cAMP水平提高。A亞基還能ADP核糖基化視桿細(xì)胞外節(jié)膜盤的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使得GTPase失活。霍亂毒素還是一種高效的黏膜疫苗佐劑，通過抑制IL-12生產(chǎn)來誘導(dǎo)2型輔助性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

霍亂毒素B亞基（CTB）對(duì)細(xì)胞無毒，本質(zhì)上不含腺苷酸環(huán)化酶活性。CTB通過結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM1附著到細(xì)胞上，是小膠質(zhì)細(xì)胞的良好標(biāo)記物（這類細(xì)胞表面富含神經(jīng)節(jié)苷脂GM1），但不適合標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞。CTB是利用組化方法研究軸突運(yùn)輸?shù)膬?yōu)秀示蹤劑。CTB也是常用的脂筏標(biāo)記物，脂筏是富含膽固醇和鞘脂的膜微區(qū)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。

本品是偶聯(lián)上綠色熒光素-CF488A（Ex/Em=490/515nm）的重組霍亂毒素B亞基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated，簡寫：CF488A conjugated- rCTB，適用于神經(jīng)學(xué)研究中的束路追蹤，靶向神經(jīng)節(jié)苷脂GM1）結(jié)合和逆行運(yùn)輸。也可在活細(xì)胞或固定細(xì)胞成像中用作脂筏標(biāo)記物和內(nèi)吞示蹤劑。

產(chǎn)品特性：

1）同義名：Choleragenoid; CTB; CTxB；霍亂毒素B亞單位；

2）來源：大腸桿菌

3）分子量：~11.6kDa（含103個(gè)氨基酸的單一非糖基化肽鏈，Thr22-Asn124）

4）純度：≥98%（SDS-PAGE）

5）外觀：無色粉末（溶于5mM PB, pH7.0, 75mM NaCl, 50% glycerol，經(jīng)0.2μm濾膜過濾除菌）

6）內(nèi)毒素：≤0.1 EU/μg（LAL method）

保存條件: 

-20℃保存，至少6個(gè)月有效。

產(chǎn)品使用：

以下是用熒光標(biāo)記的rCTB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)流程。對(duì)于其他的應(yīng)用（比如：神經(jīng)示蹤），請(qǐng)根據(jù)應(yīng)用查找相應(yīng)的文獻(xiàn)作為參考。

一、 自行準(zhǔn)備材料

1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）（比如：NBS3021-500ml）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：NBS0218-25g）

1.3 HBSS（比如：NBS4100-500ml）

1.4 4%多聚甲醛（比如：NBS0135-500ml）

1.5 【可選】Hoehcst 33342（比如：Hoehcst 33342 貨號(hào)：NBS8032-10mg，Hoechst 33342 染色液(即用型)，10ug/ml 貨號(hào)：NBS8033-10ml）

二、 染料準(zhǔn)備

重溶：將低溫保存的CF488A conjugated- rCTB（規(guī)格：100μg）置于室溫回溫至少30min，低速離心3-5min，將粉末離心至管底。直接往瓶子加入100μl無菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鮮制備的CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3個(gè)月穩(wěn)定。亦可根據(jù)單次用量分裝后，置于-20℃避光保存，6個(gè)月穩(wěn)定，避免反復(fù)凍融。

三、 活細(xì)胞的表面標(biāo)記

3.1用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA清洗細(xì)胞一次；

3.2用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA稀釋CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作濃度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走細(xì)胞內(nèi)的緩沖液，加入新鮮配置的CF488A conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃預(yù)冷的HBSS+0.5% BSA清洗細(xì)胞三次；

3.5用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗細(xì)胞二次，之后進(jìn)行成像或接著做后續(xù)的染色。【注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，考慮是否加入核復(fù)染劑-Hoechst 33342等】

注意事項(xiàng)：

1.      本品以凍干粉形式提供，由于量比較少，初次使用前需置于室溫回溫至少30min，低速離心后，再開蓋直接往瓶內(nèi)加入合適的溶劑進(jìn)行溶解。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

附錄I幾款CF染料的光譜特征：

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