重組霍亂毒素B亞基（CF647標記，深紅色熒光）

Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF647-conjugated

產品簡介：

霍亂毒素（Cholera toxin，CTX）是霍亂弧菌產生的毒力因子，會引起嚴重腹瀉以及人體脫水。CTX屬于AB5亞基家族。天然六聚體蛋白含兩個亞基，分子量約85kDa。由一個A亞基（約27.2kDa）和五個B亞基（約11.6kDa/亞基）組成，B亞基以五聚體環的方式排列，呈明顯的五度對稱，負責毒素識別并吸附細胞表面的神經節苷脂GM1。

A亞基催化刺激性G蛋白α亞基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亞基。Gαs的活化引起腺苷酸環化酶（AC）活性增加，進而促使cAMP水平提高。A亞基還能ADP核糖基化視桿細胞外節膜盤的轉運蛋白，使得GTPase失活。霍亂毒素還是一種高效的黏膜疫苗佐劑，通過抑制IL-12生產來誘導2型輔助性T細胞的免疫應答。

霍亂毒素B亞基（CTB）對細胞無毒，本質上不含腺苷酸環化酶活性。CTB通過結合神經節苷脂GM1附著到細胞上，是小膠質細胞的良好標記物（這類細胞表面富含神經節苷脂GM1），但不適合標記少突膠質細胞或星形膠質細胞。CTB是利用組化方法研究軸突運輸的優秀示蹤劑。CTB也是常用的脂筏標記物，脂筏是富含膽固醇和鞘脂的膜微區，在細胞信號轉導和蛋白質運輸中發揮重要作用。

本品是偶聯上深紅色熒光素-CF647（Ex/Em=650/665 nm）的重組霍亂毒素B亞基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF647-conjugated，簡寫：CF647 conjugated- rCTB，適用于神經學研究中的束路追蹤，靶向神經節苷脂GM1）結合和逆行運輸。也可在活細胞或固定細胞成像中用作脂筏標記物和內吞示蹤劑。

保存條件: 

-20℃保存，至少6個月有效。

產品使用：

以下是用熒光標記的rCTB對細胞進行標記的實驗流程。對于其他的應用（比如：神經示蹤），請根據應用查找相應的文獻作為參考。

一、 自行準備材料

1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）（比如：NBS3021-500ml）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：NBS0218-25g）

1.3 HBSS（比如：NBS4100-500ml）

1.4 4%多聚甲醛（比如：NBS0135-500ml）

1.5 【可選】Hoehcst 33342（比如：Hoehcst 33342 貨號：NBS8032-10mg，Hoechst 33342 染色液(即用型)，10ug/ml 貨號：NBS8033-10ml）

二、 染料準備

重溶：將低溫保存的CF647 conjugated- rCTB（規格：100μg）置于室溫回溫至少30min，低速離心3-5min，將粉末離心至管底。直接往瓶子加入100μl無菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鮮制備的CF647 conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3個月穩定。亦可根據單次用量分裝后，置于-20℃避光保存，6個月穩定，避免反復凍融。

三、 活細胞的表面標記

3.1用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞一次；

3.2用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA稀釋CF647 conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作濃度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走細胞內的緩沖液，加入新鮮配置的CF647 conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞三次；

3.5用4%多聚甲醛固定細胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗細胞二次，之后進行成像或接著做后續的染色。【注：根據實驗需求，考慮是否加入核復染劑-Hoechst 33342等】

注意事項：

1.      本品以凍干粉形式提供，由于量比較少，初次使用前需置于室溫回溫至少30min，低速離心后，再開蓋直接往瓶內加入合適的溶劑進行溶解。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

附錄I幾款CF染料的光譜特征：

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